Ny analysmetod möjliggör detaljerad kartläggning av växtcellernas beståndsdelar

I studien, som publicerades online i september i tidskriften ”The Plant Journal Technical Advance”, deltog forskare från Umeå Plant Science Centre (UPSC) och från Palacký University, Olomouc, Tjeckien.

Växthormoner är små molekyler som finns i mycket låga koncentrationer i växter och där reglerar utvecklingsbiologiska processer. Karin Ljungs och Ondřej Nováks forskargrupper hade tidigare analyserat växthormoner på vävnads- och cellulär nivå, men analysmetoderna har tidigare inte varit tillräckligt känsliga för att mäta koncentrationerna av dessa ämnen inuti cellerna.

Växthormoner är ojämnt fördelade inuti växtceller

- Baserat på fördelningen av de proteiner som ansvarar för transport av växthormoner inom och mellan celler antog vi att växthormonerna också var ojämnt fördelade inuti cellerna. Detta har dock inte kunnat påvisas förrän nu, säger Karin Ljung som är professor vid SLU och gruppledare vid UPSC och har ett långvarigt samarbete med professor Ondřej Novák som leder Laboratory of Growth Regulators vid Palacký University.

Forskarna gav sin nya metod namnet "Fluorescence-Activated multi-Organelle Sorting", förkortat FAmOS. De märkte fyra olika organeller i cellerna med fluorescerande molekyler som tar upp ljusenergi när de belyses och sedan avger energin i form av ljus med en bestämd våglängd. Forskarna kunde sedan sortera de märkta organellerna beroende på deras storlek och den våglängd som de avgav.

Samtidigt isolering av fyra olika cell organeller

- Vi valde den här metoden eftersom tidigare fraktioneringstekniker är för tidskrävande och ospecifika. När man använder olika metoder för att isolera till exempel cellkärnor och kloroplaster är koncentrationerna av växthormoner i de två isolerade organellfraktionerna inte jämförbara med varandra, säger Ioanna Antoniadi som arbetar i Karin Ljungs grupp.

- Det var en stor utmaning att hitta de rätta förhållandena för att kunna hålla sorteringstiden så kort som möjligt och därmed bibehålla stabiliteten hos växthormonerna.

Befintliga metoder optimerades för att mäta så små mängder av växthormoner

En annan utmaning för forskarna var de ytterst låga koncentrationerna av växthormonerna i cellerna. Efter att ha separerat de fyra olika organellerna mättes koncentrationen med hjälp av vätskekromatografi kopplad till tandem-masspektrometri. Denna teknik används för att identifiera och kvantifiera föreningar med hjälp av dess massa och har länge använts för att analysera växthormoner i vävnader, organ eller celler, men inte i så små mängder som finns i 200000 organeller som var mängden organeller i en prov.

- Vi var många gånger nära masspektrometerns detektionsgräns. Som jämförelse kan man tänka sig att man löser upp en tesked av växthormonet cytokinin i en olympisk simbassäng och sedan tar ut tio mikroliter av denna blandning för analys, förklarar Vladimír Skalický som utvecklade metoden tillsammans med Ioanna Antoniadi som en del av sin doktorsavhandling i Ondřej Nováks grupp vid Palacký University.

- Mängden cytokinin i dessa tio mikroliter motsvarar mängden cytokinin i en tio dagar gammal fröplanta av backtrav som har en längd av kring fem centimeter. Vi behövde flera försök och en mängd olika kontrollförsök innan vi till slut lyckades.

Den nya metoden har stor potential för många framtida forskningsprojekt

Forskarna hoppas att deras nya metod kan användas inom många framtida forskningsprojekt, eftersom den inte är begränsad till växter utan även kan tillämpas på celler från djur, människa alger eller bakterier. Det är också möjligt att analysera andra föreningar än växthormoner efter att de cellulära beståndsdelarna har isolerats, till exempel metaboliter, proteiner samt gen-aktivitet.

- Det har varit oerhört viktigt att utveckla denna mycket känsliga och robusta metod. Den är tidseffektiv och gör det möjligt för oss att mäta koncentrationer av olika växthormoner inuti själva cellen, säger Ondřej Novák.

- En sådan högupplöst kartläggning kommer att ge en mycket bättre förståelse för hur dessa signaler styr olika cellulära processer.